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Oct 21, 2023

Fungicida

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8431 (2023) Citar este artículo

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El género fúngico Alternaria es un patógeno pan-global de > 100 cultivos, y está asociado con la mancha foliar Alternaria en expansión global en la manzana (Malus x domestica Borkh.) que conduce a una necrosis foliar severa, defoliación prematura y grandes pérdidas económicas. A la fecha, la epidemiología de muchas especies de Alternaria aún no está resuelta, ya que pueden ser saprofitas, parasitarias o cambiar entre ambos estilos de vida y también se clasifican como patógenos primarios capaces de infectar tejidos sanos. Argumentamos que Alternaria spp. no actúa como patógeno primario, sino solo como oportunista dependiente de la necrosis. Estudiamos la biología de la infección de Alternaria spp. bajo condiciones controladas y controlamos la prevalencia de enfermedades en huertos reales y validamos nuestras ideas mediante la aplicación de tratamientos sin fungicidas en experimentos de campo de 3 años. Alternaria spp. los aislamientos no fueron capaces de inducir necrosis en tejido sano, sino sólo cuando existían daños inducidos previos. A continuación, los fertilizantes aplicados a las hojas, sin efecto fungicida, redujeron los síntomas asociados con Alternaria (−72,7 %, SE: ± 2,5 %) con la misma eficacia que los fungicidas. Finalmente, las bajas concentraciones de magnesio, azufre y manganeso en las hojas se relacionaron consistentemente con la mancha foliar asociada a Alternaria. La incidencia de manchas en la fruta se correlacionó positivamente con la mancha de la hoja, también se redujo con los tratamientos de fertilizantes y no se expandió durante el almacenamiento a diferencia de otras enfermedades causadas por hongos. Nuestros hallazgos sugieren que Alternaria spp. puede ser una consecuencia de la mancha foliar en lugar de su causa principal, ya que parece colonizar la mancha foliar inducida fisiológicamente. Teniendo en cuenta las observaciones existentes de que la infección por Alternaria está relacionada con huéspedes debilitados, la distinción puede parecer leve, pero es de gran importancia, ya que ahora podemos (a) explicar el mecanismo de cómo diferentes tensiones dan como resultado la colonización con Alternaria spp. y (b) fungicidas sustitutos de un fertilizante foliar básico. Por lo tanto, nuestros hallazgos pueden dar como resultado reducciones significativas en los costos ambientales debido a la reducción del uso de fungicidas, especialmente si el mismo mecanismo se aplica a otros cultivos.

El género pan-global Alternaria comprende hongos saprotróficos que pueden volverse patógenos para varios cultivos, especialmente cuando las plantas hospedantes están debilitadas y bajo estrés1,2,3. Hay más de 100 especies de plantas hospedantes, incluidos cultivos importantes como patata, tomate, trigo, col, girasol, algodón, soja y manzana, en los que los hongos suelen provocar lesiones necróticas4,5,6,7,8. Debido a su amplia gama de huéspedes, Alternaria se encuentra entre los patógenos más dañinos del mundo. En la manzana (Malus x domestica Borkh), los síntomas asociados con Alternaria incluyen manchas en las hojas y manchas subsiguientes en la fruta, y pueden provocar una defoliación del 85 % y hasta un 80 % de frutas infestadas por huerto (Fig. 1 complementaria), lo que genera grandes pérdidas económicas1,7. ,9,10,11. En Asia se cree que es económicamente la enfermedad más importante para la producción de manzanas12,13. A nivel mundial, la producción de manzanas está dominada por unas pocas variedades: 'Golden Delicious', 'Red Delicious', 'Fuji', 'Gala'. Estas 4 variedades principales representan el 60,3 % de la producción mundial (si se excluye a China, para la cual la calidad de los datos es menos segura, es del 50,8 %, datos de 2015), todas las cuales son susceptibles a la mancha foliar por Alternaria, lo que exacerba el impacto de la enfermedad14, 15,16. Además, es importante mencionar que Alternaria spp. puede causar otras enfermedades en las manzanas, como la enfermedad del núcleo mohoso, que afecta la calidad interna de la fruta y genera pérdidas financieras significativas para los cultivadores y productores de manzanas durante el almacenamiento poscosecha10,17,18.

Desde el primer informe de la mancha foliar por Alternaria en la manzana en 1926 (EE. UU.), la enfermedad se ha extendido por las regiones productoras de manzana de todo el mundo (Asia, Rusia, Australia), primero en regiones con clima árido y cálido, incluido el sur de Europa19, y recientemente también regiones templadas (por ejemplo, Países Bajos, 2018)9,11,14,19,20,21,22,23. Las condiciones cálidas y los períodos de calor son necesarios para el desarrollo de la mancha foliar por Alternaria y los primeros síntomas generalmente ocurren a principios del verano (Figuras complementarias 1a y 2). Las lluvias posteriores y las caídas de temperatura a fines del verano aumentan los síntomas de manera espectacular (Figura complementaria 1b) que conducen a una defoliación severa (Figura complementaria 1c) y manchas de frutos (Figura complementaria 1d)12. A pesar de su importancia, la epidemiología de Alternaria en la manzana aún no se conoce bien. En consecuencia, la estrategia de protección de las plantas para controlar la enfermedad de Alternaria no es específica y, a menudo, no es efectiva. Los agricultores aplican regularmente fungicidas mediante fumigaciones de rutina con hasta ocho tratamientos por temporada de cultivo como estrategia de seguro de cosecha17,24. Sin embargo, la política agrícola actual tiene como objetivo reducir drásticamente el uso de pesticidas (por ejemplo, hasta un 50 % de reducción para 2030; Comisión Europea), particularmente porque los pesticidas sintéticos constituyen una de las amenazas más importantes para los organismos no objetivo y para la contaminación del suelo y agua25,26,27,28,29,30. Por lo tanto, actualmente existe una gran demanda de enfoques alternativos en la protección de plantas para salvaguardar la seguridad alimentaria.

Es importante destacar que los síntomas de la mancha foliar por Alternaria son muy similares a una enfermedad fisiológica poco conocida de la manzana que se describió como "mancha foliar fisiológica (o necrótica)"13,17,31. Ambas enfermedades se caracterizan por manchas necróticas similares en las hojas, la misma progresión de la enfermedad y condiciones climáticas similares que favorecen el brote de la enfermedad (consulte también la "Discusión" complementaria: Dos enfermedades, mismos síntomas, Fig. 1a,b). Se cree que la mancha fisiológica de la hoja es causada por los desequilibrios de nutrientes de la hoja, provocados por las caídas de temperatura después de los períodos de calor en el verano13,31. Los primeros estudios mostraron que los fungicidas orgánicos que contienen zinc y manganeso (ditiocarbamatos), así como los tratamientos con fertilizantes foliares de magnesio y manganeso, podrían reducir la mancha foliar fisiológica32. Por el contrario, los fertilizantes potásicos, un antagonista de la absorción de magnesio, aumentaron la defoliación33. Sin embargo, estas investigaciones previas no resolvieron si y qué tipo de desequilibrio de nutrientes era responsable de la enfermedad y no desarrollaron una cura efectiva31,34. Además, los fungicidas con diferentes modos de acción (código FRAC: 3 y P 09) también redujeron la mancha foliar fisiológica, pero no se identificó un patógeno35,36.

Modelo conceptual que describe la hipótesis existente sobre la formación de manchas en hojas y frutos (Alternaria) en manzanas y nuestra nueva hipótesis, una síntesis, el complejo Alternaria. Hay dos hipótesis existentes para el desarrollo de los mismos síntomas: (A) la hipótesis del patógeno para la mancha foliar por Alternaria (biótica) y (B) la hipótesis de la mancha foliar fisiológica (abiótica). Proponemos una síntesis de ambos (C) el complejo de Alternaria. Factores ambientales conducen a desequilibrios de nutrientes con formación de manchas foliares (Ci), que posteriormente pueden ser colonizadas por Alternaria spp. (C-ii). Otros factores como la fitotoxicidad de los agentes activos y los ácaros rojos también pueden formar las condiciones necesarias para que Alternaria spp. colonización (C-iii). Un desencadenante desconocido puede cambiar la forma de vida saprofita a una forma de vida patógena (producción de toxinas) de Alternaria spp., con la mejora de los síntomas típicos como consecuencia. Del mismo modo, para la formación de manchas de frutos (D). Las lenticelas predañadas son la precondición obligatoria para la colonización por Alternaria spp., con los síntomas como consecuencia.

En resumen, las causas de la mancha foliar por Alternaria, la mancha fisiológica de la hoja y las manchas de la fruta son poco conocidas. Además, las hipótesis hasta la fecha están en conflicto con la evidencia existente: si la mancha foliar fuera causada únicamente por Alternaria spp. infección, entonces no debería verse afectado por los fertilizantes aplicados a las hojas, ya que no tienen actividad fungicida. De manera similar, si los desequilibrios de nutrientes fueran la única causa, ¿por qué los fungicidas con diferentes modos de acción reducen la gravedad de la mancha foliar? Dada la similitud en los síntomas, proponemos una nueva síntesis. Nuestra hipótesis es que la mancha foliar fisiológica y la mancha foliar por Alternaria son dos enfermedades interrelacionadas: el complejo Alternaria. La necrosis foliar inicial, causada por desequilibrios de nutrientes en los manzanos (como se muestra en la Fig. 1c), es un requisito previo necesario para la posterior colonización por Alternaria spp., que a su vez puede exacerbar la gravedad de la enfermedad.

Predecimos (1) que hay distintas firmas de nutrientes en las hojas asociadas con la enfermedad, (2) que Alternaria spp. no puede infectar tejidos sanos de manzanas sin necrosis preexistentes, y (3) que las enfermedades asociadas con Alternaria pueden controlarse previniendo las necrosis foliares iniciales mediante fertilizantes foliares.

Estudiamos el desarrollo de la enfermedad de la mancha foliar en huertos de manzanos en Tirol del Sur (Italia), donde la mancha foliar fue cada vez más frecuente desde 1999 en adelante. Para revelar qué nutrientes de la hoja podrían causar la mancha inicial de la hoja, vinculamos las concentraciones de nutrientes de la hoja (N, P, K, Ca, Mg, S, B, Fe, Mn, Cu y Zn) con la gravedad de la mancha de la hoja mediante el análisis Random Forest ( para obtener un análisis detallado, consulte los resultados complementarios S1, las figuras complementarias 4–6, la tabla complementaria 5).

Los datos se obtuvieron de árboles maduros de las variedades de manzana 'Golden Delicious' y 'Cripps Pink', que son susceptibles a Alternaria spp., y se utilizaron en nuestro experimento de campo que se describe a continuación. De los predictores, las bajas concentraciones de azufre se asociaron consistentemente con una mancha foliar más severa en ambas variedades (Fig. 2a). Sin embargo, el azufre y el magnesio fueron fuertemente colineales en el conjunto de datos (r = 0,78, Fig. 4 complementaria) y no podemos excluir un papel potencial para el magnesio, aunque la selección del modelo (basada en AIC) apoyó firmemente al azufre como elemento impulsor (Resultados complementarios S1). Además, las bajas concentraciones de manganeso también se asociaron con una alta severidad de la mancha foliar, pero solo para 'Golden Delicious' (Fig. 2b). Para validar estos resultados con datos independientes, comparamos el estado nutricional de las hojas en huertos emparejados de 'Golden Delicious' en el área de estudio con una incidencia alta o baja de manchas en las hojas en años anteriores. Este análisis mostró que los huertos de alta incidencia estaban de hecho asociados con bajas concentraciones de azufre, magnesio y especialmente manganeso en las hojas (Resultados complementarios S2, Figuras complementarias 7 y 8).

Relaciones entre la severidad de la mancha foliar y las concentraciones de nutrientes en las hojas. Se encontró una relación significativa para el azufre (a) y el manganeso (b). Tenga en cuenta que la mancha de la hoja se traza en una escala logarítmica. Se ajustaron líneas separadas para las variedades de manzana 'Golden Delicious' (naranja) y 'Cripps Pink' (rosa). Las líneas gruesas de colores muestran la regresión ajustada, las líneas punteadas los EE. Las líneas de puntos grises se muestran solo como ayuda visual. Consulte los resultados complementarios S1 para obtener un análisis detallado.

A continuación, estudiamos la biología de la infección de la enfermedad de Alternaria. Probamos bajo condiciones controladas si Alternaria spp. puede infectar tejidos sanos o lesionados de hojas y frutos. Inicialmente, se realizó un ensayo de disco de hoja utilizando una suspensión de esporas (1,25 × 106 esporas/ml) de cuatro Alternaria spp. distintas. aislamientos (dos A. alternata sspp. tenuissima y dos A. alternate sspp. arborescens, según la clasificación de Armitage et al. 2015) que se aislaron originalmente de la mancha de la hoja y la mancha del fruto en las manzanas. Sin embargo, este ensayo no resultó en necrosis de hojas ni en tejido sano ni en discos de hojas dañados manualmente con pinzas (Figura 9 complementaria; Tabla 7 complementaria). No encontramos indicios de una infección (amarilleo o oscurecimiento de la epidermis de la hoja), a pesar de que los aislamientos desarrollaron un micelio denso en la parte superior de la superficie del disco de la hoja (Figura complementaria 1f). Solo cuando las hojas habían sido atacadas y dañadas previamente por los ácaros rojos europeos (Panonychus ulmi; chupando y dañando las hojas), se formaron necrosis (Figura complementaria S9).

En un segundo ensayo de laboratorio, inoculamos artificialmente frutos de manzana con una densa suspensión de esporas de Alternaria spp. (A. alternata sspp. arborescens; 1,25 × 106 esporas/ml), que originalmente se aisló de frutos infectados. Después de 12 días en la cámara climática (25 °C), no detectamos manchas de frutos ni signos de infección (manchas necróticas, moho) (Fig. 10 complementaria). Esto también fue cierto cuando las manzanas tenían heridas frescas, no necróticas, lo que debería, según la literatura, facilitar una infección7. En un tercer ensayo, investigamos si las manchas de la fruta pueden expandirse en número y tamaño durante el almacenamiento (temperatura ambiente, ~ 15–20 °C). Para ello, frutos infectados y sanos fueron almacenados durante dos meses juntos en cajas, teniendo contacto superficial. Aquí, las frutas sanas (control) no desarrollaron ninguna mancha de fruta, y la cantidad de manchas de fruta en las frutas infectadas no cambió durante el almacenamiento (Fig. 11 complementaria). Por lo tanto, las manchas de la fruta no aumentaron en número ni tamaño durante el almacenamiento.

En resumen, nuestro estudio encontró que bajo condiciones controladas, nuestros aislamientos de Alternaria (A. alternata sspp. tenuissima y A. alternate sspp. arborescens) no fueron capaces de infectar tejidos sanos o heridas recientes, ni pudieron reproducir los síntomas de la hoja. Mancha y mancha del fruto en hojas y frutos.

Para investigar el papel de la necrosis foliar en Alternaria spp. ocurrencia, realizamos un experimento de campo en julio de 2019 en árboles 'Golden Delicious'. Inducimos manchas en las hojas usando un herbicida (Carfentrazone-ethyl) y examinamos si esto conducía a la aparición de Alternaria spp. En septiembre, la densidad de esporas de Alternaria fue en promedio 14 veces mayor en las manchas foliares inducidas por herbicidas que en la mancha foliar natural de Alternaria (Fig. 12 complementaria). En octubre, la densidad de esporas había aumentado en la mancha foliar natural de Alternaria, pero aún era considerablemente (2,7 veces) más baja que en las manchas foliares inducidas por herbicidas (Tabla complementaria 8), lo que indica que las necrosis preexistentes son una condición previa importante para colonización y que Alternaria spp. posteriormente sigue la propagación de la necrosis.

Para validar nuestra hipótesis, llevamos a cabo un experimento de campo de tres años en huertos de manzanos. En árboles maduros de las variedades 'Golden Delicious' y 'Cripps Pink', aplicamos fertilizantes foliares a base de azufre hechos a medida sin efecto fungicida (probados con detección de actividad fungicida in vitro, Tabla complementaria 1, Figura complementaria 15), comúnmente fungicidas usados, o ninguno (control), bajo la práctica de cultivo convencional ("producción integrada"). Durante tres años, los fertilizantes foliares redujeron la mancha foliar de Alternaria en un promedio del 72,7 % (SE: ± 2,5) para ambas variedades de manzanas (Fig. 3, p < 0,001; Tabla complementaria 2). Esta reducción fue la misma que lograron los fungicidas de uso común (72,7%, SE: ± 3,3). Los fertilizantes foliares a base de azufre también redujeron las manchas de la fruta en 'Golden Delicious' (50,2 %, SE: ± 7,3, p < 0,001, Tabla complementaria 3), mientras que los fungicidas condujeron a una reducción del 75,9 % (SE: ± 4,6) en promedio (Fig. 3, p <0,001; Tabla complementaria 2). Por el contrario, las manchas de frutos en 'Cripps Pink' fueron raras (111 veces menos que en 'Golden Delicious') y no se pudo detectar un efecto reductor de los fertilizantes foliares sobre las manchas de frutos (p = 0,721). Para 'Golden Delicious' encontramos una correlación positiva entre la mancha de la hoja y las manchas de la fruta en los tres años (r = 0,53 a 0,78, Fig. 3 complementaria; Tabla 4 complementaria).

Reducción relativa de manchas foliares y frutos asociadas a Alternaria utilizando fungicidas o fertilizantes foliares a base de azufre (SBF). Se muestra la efectividad de los fungicidas y SBF en las dos variedades de manzana 'Golden Delicious' (naranja; fertilizante: Sulfato-Mix) y 'Cripps Pink' (Pink Lady®'; rosa; fertilizante: azufre microfino) en comparación con la práctica convencional (control, puntos línea en cero). La prueba de campo se realizó en un diseño de bloques aleatorios (n = 4 por tratamiento) de 2017 a 2019 en el Centro de Investigación de Laimburg, Tirol del Sur, Italia. La reducción de manchas en las hojas en ambas variedades fue significativa en todos los años (p < 0,0001, Tabla complementaria 2), mientras que la reducción en las manchas de la fruta solo fue significativa para 'Golden Delicious' (Tabla complementaria 3). Las manchas de fruta en 'Cripps Pink' fueron muy raras o ausentes (control: número medio de manchas de fruta-1 ± SE: 0.0092 ± 0.0049; ver la Fig. 14 complementaria), lo que hizo que no fuera apropiado calcular las reducciones relativas.

Con base en nuestro estudio, hemos encontrado evidencia que desafía la idea generalizada de que Alternaria spp. es la causa principal y directa de la mancha foliar por Alternaria en la manzana y sugiere que la enfermedad es más compleja de lo que se pensaba anteriormente. Nuestros hallazgos contradicen la idea de que el hongo actúa como un patógeno primario, ya que la inoculación artificial de tejido sano falló y las manchas de la fruta no se expandieron durante el almacenamiento. Además, observamos una fuerte asociación entre las bajas concentraciones de nutrientes en las hojas y la incidencia de enfermedades.

Además, nuestro estudio demostró que los fertilizantes foliares simples a base de azufre, que no inhiben el crecimiento de hongos, pueden reducir la mancha foliar por Alternaria con la misma eficacia que los fungicidas. Dado que los fertilizantes fortalecen la condición fisiológica de la planta y no actúan directamente sobre el hongo, sugerimos que trate la causa principal de la enfermedad y que la infección por Alternaria sea un síntoma secundario. Con base en esto, proponemos la nueva síntesis de que la mancha foliar fisiológica y la mancha foliar por Alternaria no son enfermedades distintas sino parte de un continuo, que llamamos el "complejo de Alternaria". Esta concepción continua reconoce la naturaleza multifactorial de la inducción y proliferación de la enfermedad, y destaca la importancia de considerar tanto los factores fisiológicos como los fúngicos involucrados en el desarrollo de la enfermedad (Fig. 1).

Argumentamos que las esporas ubicuas de Alternaria colonizan cualquier necrosis foliar preexistente y no pueden iniciar estas necrosis por sí mismas. En cambio, las manchas foliares iniciales son causadas principalmente por desequilibrios de nutrientes en las hojas (Fig. 1c-i). Sin embargo, las necrosis foliares iniciales también se pueden formar a través de otros mecanismos, por ejemplo, los agentes activos particulares rociados durante condiciones climáticas particulares pueden tener efectos fitotóxicos (Fig. 1c-ii)37,38,39. Independientemente de la causa de las manchas foliares iniciales, las esporas ubicuas de Alternaria posteriormente colonizarán y agrandarán las necrosis existentes (Fig. 1c-iii), potencialmente a través de la liberación de toxinas (por ejemplo, alternariol, altenueno, ácido tenuazónico), lo que provocará una defoliación prematura. y pérdida de rendimiento 40,41,42,43,44. Es probable que se aplique el mismo mecanismo para la formación de manchas en la fruta y solo las lenticelas previamente dañadas pueden ser colonizadas por Alternaria spp. (Figura 1d). Este papel patógeno oportunista de Alternaria spp. en la progresión de la enfermedad explica por qué diferentes fungicidas también reducen los síntomas en hojas y frutos, pero una infección primaria por Alternaria no es la causa inicial.

Esta síntesis representa una mejora significativa con respecto a las hipótesis originales en competencia, ya que proporciona una explicación integral de los resultados inconsistentes y complejos relacionados con la enfermedad de Alternaria (consulte la "Discusión: Dos hipótesis inadecuadas" complementaria).

Queremos reconocer que nuestros experimentos de infección se realizaron en condiciones controladas y con un número limitado de aislamientos y, por lo tanto, representan solo una fracción de las posibles interacciones entre Alternaria spp. y la planta huésped de la manzana. Además, existe una variabilidad significativa en los resultados de otros experimentos de infección con Alternaria spp., donde algunos estudios informaron inoculación artificial fallida sin síntomas o inconsistencias14,45,46,47, mientras que otros informaron inoculación exitosa con síntomas15,48,49, 50 La patogenicidad variable (infección exitosa o fallida) de Alternaria spp. típicamente se explica por "patotipos" de cepas de Alternaria, específicamente A. alternata, que pueden producir diferentes metabolitos como toxinas específicas del huésped que actúan como factores de virulencia o factores de colonización como el ácido tenuazónico y el alteraniol41,42,51,52. Estas toxinas pueden desencadenar la muerte celular y la necrosis en cuestión de horas cuando se aplican directamente al tejido vegetal40,44,53. Desafortunadamente, nuestro estudio de inoculación artificial se realizó sin una caracterización metabólica de los aislamientos utilizados, y el fracaso de la inoculación puede deberse a una menor virulencia de estos aislamientos54.

Dado el estado actual de la investigación de Alternaria, creemos que es importante reexaminar el énfasis puesto en las toxinas y las pruebas de toxicidad, particularmente en lo que respecta a la caracterización de la virulencia en Alternaria spp. y para el cumplimiento de los postulados de Koch. Creemos que es necesario un examen crítico de este método para garantizar una interpretación precisa de la biología de la infección de Alternaria spp. En los "bioensayos de hojas desprendidas" o "bioensayos de patogenicidad", este efecto directo de la toxina se utiliza para inferir la patogenicidad (patotipo frente a no patotipo) de las cepas de Alternaria9,55,56. No obstante, estos ensayos pueden plantear algunos desafíos, porque (a) no rastrean el proceso biológico de infección, es decir, la germinación de esporas y la invasión de hifas en el tejido del huésped para "establecer contacto y obtener nutrientes"1. Esto se debe a que los ensayos de patogenicidad generalmente se realizan en tejido herido, a veces con las toxinas purificadas y sin el hongo9,23,40,42,48,53,55,57. Además, (b) las necrosis foliares provocadas en estos ensayos (necrosis venosa, extensa) son sintomáticamente muy diferentes de las manchas foliares en el campo (manchas concéntricas)45,46,55,56,58. Finalmente, (c) estas necrosis permanecen constantes en tamaño y no aumentan de tamaño cuando se utilizan tapones de micelio como inóculo47,48. En general, es importante reconocer que los ensayos de patogenicidad tienen limitaciones cuando se trata de determinar si Alternaria spp. puede infectar efectivamente las plantas hospedantes. Además, vale la pena señalar que no hay evidencia definitiva de infección primaria (es decir, la penetración de las hifas en el tejido sano) por Alternaria spp. en plantas de manzano. Las diferencias entre el "efecto toxina", "infección", "patógeno secundario" y "patógeno primario" pueden parecer sutiles, pero para evitar un tratamiento ineficaz, es fundamental comprender la biología de infección de un patógeno. Para Alternaria, la práctica actual ha llevado a una clasificación errónea de un patógeno secundario oportunista como patógeno primario, lo que lleva a un tratamiento innecesario e inespecífico con fungicidas.

Es importante destacar que existe una fuerte analogía entre la "enfermedad de Alternaria" en la manzana y la "enfermedad de Alternaria" en otros cultivos. En la papa, las esporas de Alternaria solani, que se piensa que causan el tizón temprano, se producen principalmente en las hojas muertas o moribundas7. Además, el tizón temprano también está asociado con el estrés por calor y la deficiencia de nutrientes59,60. En varios cultivos, los tratamientos con fungicidas tienen poca eficacia, mientras que las aplicaciones de magnesio (papa, amapola) y zinc (tomate) controlaron el tizón temprano, lo que indica que un mecanismo fisiológico similar puede operar aquí como en la manzana. Asimismo, la aplicación foliar de MgSO4 en amapola redujo la gravedad de la enfermedad de diferentes hongos moho, incluida Alternaria brassicae f. somnifer61. En el caso del algodón, se ha demostrado que el estrés por frío es el factor predisponente clave para una infección por A. alternata3. En resumen, varios estudios han demostrado que Alternaria está relacionada con la deficiencia de nutrientes o que la infestación puede controlarse con fertilizantes62,63,64,65,66,67, pero también otros estreses están relacionados con Alternaria spp., como sequía, senescencia, daños por virus e insectos o estrés por frío 3,7,68,69,70,71. Por lo tanto, varios estreses abióticos y bióticos (p. ej., ácaros en nuestros resultados) en las plantas pueden desencadenar la colonización por Alternaria spp. también en otras plantas.

La asociación de Alternaria spp. a diferentes tipos de estrés suele explicarse por una mayor susceptibilidad debida a un huésped "debilitado"2,7. Sin embargo, el término "debilitado" se refiere a varios cambios en los procesos fisiológicos, como los mecanismos de respuesta al estrés 72,73,74. La hipótesis del huésped 'debilitado' también implica que puede ocurrir una infección o penetración del tejido vegetal fresco, lo que no está en consonancia con el estilo de vida saprófito de Alternaria spp.1,2,7. Por el contrario, planteamos la hipótesis de que el tejido vegetal muerto es la condición previa clave para la colonización de Alternaria spp. en manzana y probablemente también para otras plantas. La nueva hipótesis explica por qué una amplia gama de diferentes tensiones se asocia con Alternaria spp.: todas estas tensiones conducen a la necrosis que posteriormente puede ser colonizada por Alternaria spp., un hongo principalmente saprofito.

Somos conscientes de las interacciones multifactoriales entre diferentes especies de Alternaria, diferentes plantas hospedantes con varios cultivares. Aunque no probamos todas las variedades susceptibles, creemos que nuestros resultados son representativos, ya que la mayoría de estas variedades están relacionadas genéticamente y es probable que la dinámica de la enfermedad sea similar. Por otro lado, una gran parte de la investigación se está centrando en la "patogenicidad" de diferentes especies/aislados de Alternaria (patotipos) centrándose en las toxinas producidas o los genes relacionados6,44,75,76,77,78. Se han descrito numerosas fitotoxinas de Alternaria, y recientemente se descubrió que se produce una nueva toxina putativa en 14 aislamientos diferentes44,79. La nueva toxina no estaba relacionada con las regiones conocidas del gen de la toxina de Alternaria (AMT1, AMT4, AMT14), lo que subyace a la complejidad de la investigación sobre la patogenicidad de Alternaria. Sin embargo, argumentamos que la tipología del patotipo y su potencial para producir toxinas no pueden explicar por qué los tratamientos con fungicidas y fertilizantes redujeron igualmente los síntomas. Implicaría que todos los diferentes tipos de fertilizantes y nutrientes (ver referencias anteriores; N, P, K, Mg, Zn, S, Mn) pueden "inactivar" toxinas múltiples y altamente efectivas (necrosis en pocas horas) cuya célula- Se cree que el efecto dañino es el proceso clave para la infección 40,41,80,81 (ver también "Discusión" complementaria).

Aunque las causas últimas de los desequilibrios de nutrientes de las hojas necesitan más investigación, los factores climáticos y, en particular, las olas de calor y las subsiguientes caídas de temperatura se han implicado como impulsores clave17,31. El aumento de las temperaturas y una mayor frecuencia de períodos de calor y extremos climáticos en la región de estudio son consistentes con la mayor frecuencia y distribución espacial (limitada a los fondos de valles cálidos) de la mancha foliar por Alternaria y la primera aparición de manchas de frutos hace 22 años (en 1999) 82. Además, la continua expansión de la mancha foliar a regiones de climas templados (menos cálidos) apunta al cambio climático como un impulsor clave 23. Sin embargo, los mecanismos ambientales y fisiológicos responsables de la baja disponibilidad, absorción, lixiviación o secuestro de Mn, S y Mg siguen siendo deficientes. comprendido. El estado variable del agua del suelo (sequía o anegamiento) y los regímenes de riego desequilibrados pueden ser impulsores potenciales, ya que influyen en gran medida en la disponibilidad de nutrientes, en particular el manganeso 35. Es importante destacar que, si el complejo de Alternaria es realmente impulsado por los extremos climáticos inducidos por el cambio climático, su importancia para la producción de manzanas probablemente aumentará sustancialmente en un futuro próximo.

En resumen, nuestros resultados muestran que Alternaria spp. no es la causa principal de la mancha foliar y de la fruta por Alternaria, sino un patógeno oportunista. Alternaria spp. solo coloniza tejido necrótico preexistente de hojas y frutos de manzano. Estas necrosis preexistentes son causadas por un desorden nutricional fisiológico (que involucra S, Mn y Mg), apareciendo primero como una mancha foliar fisiológica. Sin embargo, también otras causas (p. ej., ácaros rojos, fitotoxicidad de los agentes activos) pueden desencadenar necrosis iniciales y, por lo tanto, actuar como condición previa para la colonización por Alternaria spp. Finalmente, demostramos que los fertilizantes foliares a base de azufre se pueden usar como un método preventivo simple para controlar las enfermedades asociadas con Alternaria. La aplicación de estos fertilizantes foliares puede reducir considerablemente el uso global de fungicidas en la producción de manzanas. El impacto potencial se verá fuertemente exacerbado si los mismos mecanismos también se aplican en otros cultivos, como suponemos, y también pueden ser tratados con fertilizantes foliares.

Todos los ensayos de campo se realizaron entre 2017 y 2019 en los huertos de manzanos del Centro de Investigación de Laimburg, Tirol del Sur, Italia (224 msnm; 46,3825°/11,2887°). Establecimos nuestros experimentos en dos bloques, el bloque 'Golden Delicious' (plantado en 2012) y el bloque 'Cripps Pink' ('Pink Lady®') (plantado en 2000). Las hileras de manzanos maduros se orientaron de norte a sur y crecieron como un eje delgado de 3,5 m de altura. Configuramos los experimentos como un diseño de bloques al azar con 4 repeticiones, donde una fila constituye un bloque. Para minimizar la influencia de los tratamientos vecinos, incluimos dos "filas de amortiguamiento" entre los bloques. Las parcelas dentro de un bloque constaban de 15 árboles consecutivos. Los tres primeros y los tres últimos árboles de una parcela, colindantes con las otras parcelas, no fueron considerados para la evaluación.

Para la evaluación de los tratamientos (ver abajo), se recolectaron frutos y hojas durante los periodos comunes de cosecha (Golden Delicious: 19 de septiembre de 2017, 19 de septiembre de 2018, 26 de septiembre de 2019; 'Cripps Pink': 7 de noviembre de 2017, 8 de noviembre de 2018, 15 de noviembre de 2019). De cada parcela recolectamos al azar dos cajas de manzanas (~ 50–65 manzanas por caja), una para cada lado del árbol (oeste y este). Las frutas se transfirieron inmediatamente a la celda de almacenamiento en frío (2,5 °C y 90 % HR) hasta su posterior evaluación. Las hojas se recolectaron aleatoriamente el mismo día de los mismos árboles, 100 hojas por parcela (repetición) divididas equitativamente entre los lados del árbol (50 hojas por lado) y se colocaron en bolsas de papel. Para cuantificar la mancha foliar de "Alternaria", cada hoja se analizó visualmente en el laboratorio y se asignó a una clase de infestación, correspondiente al área necrótica porcentual de una hoja (0%, 0–5%, 5–10%, 10–15%, 15–20%, 20–30%, > 30%). Las frutas también se asignaron a las clases de infestación, considerando el número de manchas de fruta detectadas por manzana (0, 1–2, 3–5, > 5). Los resultados se agruparon para cada parcela, lo que representa una réplica/punto de datos. La mancha de la fruta estuvo casi ausente en el tratamiento con fungicidas de 'Cripps Pink' y, por lo tanto, no se evaluó.

Los huertos se manejaron de acuerdo con las pautas para el cultivo integrado de frutas de pepita con la excepción de que no se aplicaron fertilizantes ni agentes activos específicos de Alternaria83. Así, nuestras parcelas testigo representan manejo integrado sin tratamientos específicos de Alternaria, mientras que las demás parcelas experimentales fueron: manejo integrado más tratamiento experimental correspondiente. Los tratamientos probados se desarrollaron en función de los resultados anteriores y la observación de campo (ver la Fig. 13 complementaria). Nuestro tratamiento contra la mancha foliar por Alternaria fue para Golden Delicious, la mezcla de sulfato (SBF, consulte la Tabla complementaria 1 para ver la composición). Para 'Cripps Pink' utilizamos en 2017 la suspensión de azufre Thiopron® (UPL Italia srl; 2017: 0,605 l/hl = 500 g S/hl). Como Thiopron® causó una capa blanca en las manzanas, en conflicto con los criterios de venta, redujimos la cantidad aplicada en 2018 (0,242 l/hl = 200 g S/hl) y sustituimos en 2019 Thiopron® por otro producto de azufre común (azufre microfino). ), Thiovit® (Syngenta Italia spa). Thiovit® se aplicó según la dosis recomendada (240 g/hl = 190 g S/hl). Este cambio a otro producto de azufre no tuvo una influencia fundamental en nuestros resultados, ya que el efecto sobre la mancha foliar es independiente del tipo/producto de azufre (consulte la Fig. 13 complementaria). A todos los tratamientos descritos anteriormente los denominaremos “abono foliar a base de azufre” (SBF). La frecuencia de aplicación por temporada fue para Golden Delicious 4 aplicaciones en 2017 y 5 aplicaciones en 2018 y 2019. Para 'Cripps Pink', la frecuencia de aplicación fue 6 veces por temporada en los tres años (2017-2019; consulte la Tabla complementaria 1). Todos los tratamientos se aplicaron con un pulverizador de huerto experimental (ventilador axial, boquillas inyectoras) con una cantidad de agua utilizada de 15 hl/ha.

Para comparar la efectividad del SBF con la práctica actual, también monitoreamos los tratamientos en los que se aplicaron varios fungicidas para controlar la mancha foliar y la mancha del fruto por Alternaria. Probamos dos agentes activos con dos modos de acción diferentes en 'Golden Delicious': (I) Fosfonato de potasio (código FRAC: P 07; 2017: "FosfiD'oR 250", Orius; 2018–2019: "Century Pro", BASF ) y (II) difenoconazol (código FRAC: 3; 2017-2019: "Score 10 WG", Syngenta). Las dosis aplicadas fueron: FosfiD'oR 250: 3 L/ha (45,3% Fosfonato potásico), Century Pro: 1,9 L/ha (50,4% Fosfonato potásico), Score 10 WG.: 750 g/ha (10% Difenoconazol). Cada uno de estos fungicidas se ensayó por separado. Como 'Cripps Pink' tiene un período de crecimiento mucho más largo (cosecha en noviembre) y la frecuencia de aplicación está limitada por las regulaciones legales para cada agente activo a un número determinado, probamos un tratamiento Fungicida-Mix. El Fungicida-Mix incluía los siguientes fungicidas: Syllit® 65 (UPL), con 1,38 kg/ha (65% Dodine), Polyram® DF (BASF), con 2,6 kg/ha (70% Metiram), Geoxe ® (Syngenta), con 0,45 kg/ha (50% Fludioxonil). Todos los fungicidas se aplicaron de acuerdo con las buenas prácticas agrícolas, generalmente después de las lluvias cuando el riesgo de infecciones fúngicas es alto. La frecuencia de tratamiento de fungicidas por temporada de cultivo fue para 'Golden Delicious' 2017: 8, 2018: 5, 2019: 11, y para 'Cripps Pink': 2017: 11, 2018: 7, 2019: 8. Para estadísticas, resultados de todos Se incluyeron parcelas de fungicidas y, por lo tanto, representan un efecto promedio de diferentes fungicidas ('Golden Delicious': 2 agentes activos; 'Cripps Pink': 4 agentes activos).

Dentro de nuestra prueba de campo (configuración experimental como se describe anteriormente), probamos en 2017 adicionalmente el efecto de diferentes fertilizantes foliares y concentraciones de fertilizantes en la mancha foliar. Los fertilizantes utilizados fueron: Thiopron® (UPL Italia srl), Fytofert® S (Desangosse Italia srl), Sulfato-mix (ver Tabla S1). Los tres fertilizantes se aplicaron en dos concentraciones diferentes, que siempre se corrigieron para recibir una concentración final de 50 g de azufre hl-1 y 500 g de azufre hl-1 (Thiopron®: 61 ml hl-1 y 606 ml hl-1, 68 ml hl−1 y 685 ml hl−1, Sulfato-Mix: 500 g S hl−1 como se describe en la Tabla S1, para 50 g S hl−1 reducimos MgSO4 a 318,8 g hl-1.

Para probar si la mezcla de sulfato (S-Mix, consulte la Tabla complementaria 1) tiene un efecto fungicida en Alternaria spp., Realizamos una detección de actividad fungicida en el laboratorio. Para eso, usamos placas de microtitulación de 6 × 4 en las que llenamos PDA como control, PDA mezclado con S-Mix (PDA + S-Mix) en su concentración aplicada en campo (ver arriba) y PDA mezclado con S-Mix con 1 /10 de la concentración utilizada (PDA + 1/10 S-Mix). Los tres medios (PDA, PDA + S-Mix, PDA + 1/10 S-Mix) se inocularon con cuatro aislamientos diferentes de Alternaria (A02/F172, A02/F152, A15/271, A15/31) con tres repeticiones cada uno ( 9 pocillos por aislamiento). Después de la inoculación, las placas se transfirieron a una incubadora a 25 °C. El crecimiento del micelio (diámetro, mm) se midió después de 24 h con una regla y se comparó con el control (PDA). De cada réplica se determinó el diámetro con dos medidas en disposición ortogonal (réplicas técnicas). El crecimiento de micelio no se redujo en 1/10 de S-Mix y S-Mix en los medios (PDA), pero aumentó ligeramente (p <0,001; Fig. 13 complementaria). Las interacciones entre los medios (concentración) y los aislados fueron significativas (p = 0,007) ya que el crecimiento de un aislado (A02/F172) no mostró diferencias entre las concentraciones. Por lo tanto, S-Mix no tiene efecto fungicida.

Para el análisis de nutrientes, tomamos muestras de hojas de diferentes parcelas/tratamientos dentro de nuestra prueba de campo (2017 a 2019). Durante los tres años, muestreamos alrededor de 9900 hojas de 891 árboles tomados de 99 parcelas para 'Golden Delicious', para 'Cripps Pink' esto fue respectivamente 9100, 819 y 91. Agrupamos todas las hojas recolectadas de una parcela, por lo que cada parcela representa un replicar y un punto de datos en el análisis estadístico posterior. Se evaluó la mancha foliar en todas las hojas como se describió anteriormente y posteriormente se analizó la concentración de nutrientes. Para ello, las hojas (100 por parcela) se secaron en una estufa a 60 °C durante al menos 72 h en un secadero de compartimiento y se retiraron los pecíolos antes del análisis. El análisis químico fue realizado por el Laboratorio de Análisis de Suelos y Plantas de Laimburg (acreditado según ISO 17025:2005). El nitrógeno se analizó con un analizador elemental según DIN EN ISO 16634-1:2009 (según Dumas). Otros nutrientes (P, K, Ca, Mg, B, Fe, Mn, Cu, Zn, S) se analizaron con espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) según EPA 3052 1996 + EPA 6010D 201. Todas las concentraciones de nutrientes dadas son por "peso seco".

Los huertos de manzanos pueden diferir dramáticamente en la prevalencia de la infestación de la mancha foliar y la mancha de la fruta por Alternaria, incluso si los huertos están muy cerca y son de la misma variedad de manzana. Para validar nuestro análisis de nutrientes de la hoja, seleccionamos cuatro pares de huertos 'Golden Delicious'. Para minimizar la influencia del manejo, los pares de huertos fueron seleccionados en base a dos criterios: (I) Cada par fue manejado por el mismo agricultor (tres agricultores) y (II) cada par de huertos consistía en un huerto que mostraba los últimos ~ 5 años sin infestación o con infestación mínima y un huerto caracterizado por una infestación regularmente muy fuerte (abundancia natural). Un par no cumplió con el criterio I) ya que emparejamos los huertos de Laimburg con un huerto externo. De cada huerto, se tomaron muestras de hojas tres veces en 2018 (25 de mayo, 20 de julio, 7 de septiembre) y dos veces en 2019 (17 de mayo, 9 de julio), con dos repeticiones por huerto y punto de tiempo y 50 hojas de 15 árboles por repetición. En la primera fecha de muestreo (25 de mayo de 2018) tomamos tres repeticiones por huerto. Las hojas se analizaron para la concentración de nutrientes, como se describe anteriormente.

Todos los aislamientos utilizados en el estudio se obtuvieron de la colección de cultivo de hongos en Laimburg y se aislaron inicialmente de la mancha de la hoja del manzano y de las manchas de la fruta en varios huertos ubicados en Tirol del Sur, Italia. La clasificación filogenética de los aislados se determinó mediante el método propuesto por Armitage et al. en 2015, y los resultados revelaron que dos aislamientos pertenecían a A. alternata sspp. tenuissima, mientras que los dos aislamientos restantes pertenecían a A. alterne sspp. arborescente.

Se inocularon placas de PDA (dos por aislamiento) con aislamientos de Alternaria de la colección Laimburg y se mantuvieron en una incubadora a 25 °C. Después de una semana, cortamos un cubo de 1,5 cm3 del micelio crecido y lo trituramos en un mortero con 200 µl de solución estéril de tween al 0,03%. Después de que el micelio estuvo completamente molido, agregamos 4.8 ml de solución de tween al mortero. Se pipetearon 750 µl de la suspensión de micelio a placas V8 (4 placas por aislado), que previamente se cubrieron con discos de celofán empapados (agua estéril). Las placas cerradas (parafilm) se mantuvieron en una cámara climática a 25 °C y un programa de luz de 8 h de luz negra (Philipps TL-D 36W BLB 1SL/25) y 16 h de oscuridad. Después de 3 semanas, la capa de celofán-micelio se retiró con un par de pinzas y se puso junto con 8 ml de la solución de tween en un tubo falcon de 50 ml (dos placas por tubo). Los tubos Falcons se agitaron durante un minuto, se colocaron durante 5 minutos en un baño ultrasónico (40 kHz) y se agitaron nuevamente durante 1 minuto. Para separar el micelio de las esporas, el contenido del tubo falcon se filtró posteriormente (malla de 80 µm) y la parte líquida resultante se analizó mediante un hemocitómetro (cámara de recuento de Fuchs-Rosenthal) para determinar la densidad de las esporas. Todas las suspensiones de esporas se diluyeron hasta una densidad final de 1,25 × 106 esporas/ml.

Con este experimento queríamos probar la influencia de diferentes lesiones foliares en la infección por Alternaria spp. Hubo cuatro tipos diferentes de tratamientos para el daño de la hoja: "ninguno" = tejido sano, "1 h antes" = lesionado con un par de pinzas combinadas una hora antes de la inoculación, "7 días antes" = lesionado con un par de pinzas combinadas 7 días antes de la inoculación, "Ácaros" = hojas recolectadas el día de la inoculación de un huerto actualmente atacado severamente por ácaros rojos europeos (Panonychus ulmi). Estas hojas recolectadas tenían un daño visible de ácaros. Todas las hojas se recolectaron del huerto del Centro de Investigación de Laimburg, excepto las hojas atacadas por ácaros provenientes de una granja cercana (~ 3 km de distancia).

Para el tipo de lesión "7 días antes", se marcaron hojas de 'Golden Delicious' y se lastimaron en los árboles con un par de alicates, 7 días antes de que comenzara el experimento. Las hojas dañadas, las hojas sanas y las hojas dañadas por los ácaros se recolectaron en la mañana de la inoculación experimental (29 de mayo de 2019) y se utilizaron para cortar discos de hojas con un sacacorchos (15 mm de diámetro). Se cortaron cuatro discos por hoja al azar, evitando la inclusión de la nervadura central. Para reducir la posible presencia de otros patógenos y mohos, los discos se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio al 3 % y en una solución de etanol al 70 %, cada uno durante dos segundos y se lavaron durante 10 s en agua estéril. Los discos de hoja pertenecientes al tipo de lesión "1 h antes" se lesionaron posteriormente con un par de alicates. Seleccionamos cuatro aislamientos diferentes, que pertenecían a los clados A. alternata sspp. tenuissima (A18/F01/14, A18/F03/09) y dos A. alternata sspp. arborescens (A18/F05/11, A18/F10/14; según Armitage et al.75) Los aislamientos se aislaron originalmente de diferentes huertos infestados del Tirol del Sur. Nuestra configuración experimental fue un diseño completamente cruzado de los factores "Tipo de lesión" y factor "aislados", ambos con cuatro aislados diferentes, lo que resultó en 16 combinaciones de tratamientos. Usamos cuatro repeticiones para cada combinación de tratamientos (cuatro placas petri), que constaban de cuatro repeticiones técnicas (cuatro discos por placa).

Se llenaron placas Petri pequeñas (55 mm de diámetro) con una capa de perlas de vidrio esterilizadas en autoclave (3 mm de diámetro) y agua estéril (3 ml) hasta cubrir las perlas. En cada plato colocamos 4 discos de hojas, correspondientes al mismo tratamiento. De acuerdo con los cuatro aislamientos, teníamos cuatro suspensiones de esporas diferentes de las cuales aplicamos 60 µl con una pipeta en la herida de cada disco de la hoja (centro). Como control (n = 4), usamos agua estéril que aplicamos como se indicó anteriormente en discos de hojas de cada "Tipo de lesión". En conclusión, cada placa petri incluía discos de hojas de un "Tipo de lesión" y un aislado o agua pura (control; en total 5 tratamientos × 4 aislados × 4 repeticiones = 80 placas). Posteriormente, las placas de Petri se colocaron en una cámara climática (Proclimatic ACLIL 900 Lt) a 25 °C, 65 % HR y un programa de iluminación según la duración del día concurrente (15,5 h luz/8,5 h oscuridad, 5000 lx). Debido a la pérdida por evaporación, los días 3, 6 y 9 agregamos 2 ml de agua estéril a cada placa.

Después de 13 días (12 de junio de 2019), se evaluó cada disco para la mancha necrótica de la hoja de acuerdo con las siguientes clases [% de área necrótica]: 0, 0–1, 1–5, 5–10-10–15, 15–20, 20–30, > 30. La transformación en datos numéricos se realizó como se describe anteriormente (experimento de campo principal). Nota: evaluamos el cambio en el área necrótica en relación con el área necrótica de los controles correspondientes, que ya diferían antes de la inoculación debido a los diferentes tratamientos de "Tipo de lesión".

Las manzanas maduras 'Golden Delicious' se cosecharon en el Centro de Investigación de Laimburg el 18 de septiembre de 2019. En el laboratorio, la superficie de la manzana se limpió con toallas de papel empapadas en una solución de etanol al 70 %. Con un rotulador se dividió la superficie de la manzana en tres segmentos esféricos iguales. Cada segmento‚ se asignó a uno de los tres tipos de lesión (tratamiento, n = 4): Aguja = lesionado con aguja de jeringa (5 pinchazos ~ 5 mm de profundidad), Papel de lija = lesionado con papel de lija (~ 6 cm2 de manzana lesionada superficie), Ninguno = tejido sano no tratado. Por medio de un cepillo, las áreas lesionadas y el tejido sano fueron inoculados con una suspensión de esporas (aislado A18/F10/14, A. alternata sspp. arborescens). Como control, usamos agua estéril que aplicamos de manera análoga a la suspensión de esporas en cuatro manzanas adicionales con los mismos tipos de lesiones. Las manzanas se transfirieron a una caja de plástico con toallas de papel empapadas en agua en el fondo para aumentar la humedad del aire. Las manzanas se colocaron en una rejilla de metal en la caja para mantenerlas secas. Las cajas se taparon con una tapa (no hermética) colocada en una cámara climática (Proclimatic ACLIL 900 Lt, 25 °C, 65% HR) y un programa de luz según la duración del día concurrente (12 h luz/12 h oscuridad). Se rellenó con agua los días 4 y 8 para mantener las toallas húmedas. Después de 12 días, las manzanas se controlaron en cuanto a manchas en los frutos y formación de necrosis como antes.

Queríamos probar si (a) las manchas de la fruta aumentan en número y tamaño durante el almacenamiento y (b) si las manzanas sanas pueden infectarse con manzanas infectadas cercanas durante el almacenamiento. Para ello, se cosecharon manzanas 'Golden Delicious' en septiembre (fecha común de cosecha) de un huerto con severa infestación de manchas en frutos de Alternaria (media: 10 manchas por manzana). Se tomaron manzanas sanas de otro huerto sin infestación. Se colocaron manzanas sanas sin manchas de fruta junto con las manzanas infectadas en cajas de plástico (27 de septiembre de 2000). Ambas cajas se almacenaron a temperatura ambiente (15–20 °C), una al 65 % de HR (10 manzanas infestadas, 15 sanas) y la otra al 100 % de HR (11 infestadas, 10 manzanas sanas), respectivamente. Después de dos meses (25 de noviembre de 2000), las manzanas se controlaron nuevamente para detectar manchas en la fruta y se compararon con las de antes del almacenamiento.

Para probar si Alternaria spp. coloniza tejido necrótico, provocamos manchas foliares necróticas artificialmente en el campo. Para ello, se pulverizó el herbicida Spotlight® Plus (Belchim; Carfentrazone-ethyl; concentración: 3 ml/L) mediante un pulverizador manual sobre hojas de 'Golden Delicious' en el huerto de Laimburg. Seis árboles por parcela (n = 4) fueron tratados el 8 de julio de 2019 dentro de nuestra prueba de campo principal. Las manchas foliares artificiales resultantes eran claramente distinguibles de las manchas foliares naturales. El 3 de septiembre y el 14 de octubre de 2019, se recolectaron cinco hojas por parcela con síntomas claros de las parcelas tratadas con herbicida y las parcelas de control con mancha foliar natural. Las hojas frescas recolectadas se escanearon con una fotocopiadora para crear imágenes en color (300 ppp). Con base en las imágenes a color, determinamos el tamaño (cm2) de la mancha necrótica, mediante el software ImageJ84. Después de escanear, las hojas se secaron dentro de bolsas de papel a 60 °C durante al menos 72 h en un secador de compartimiento. A continuación, se lavaron las esporas de las hojas secas como sigue: se trituraron las hojas secas de una parcela y se llenaron juntas en un vaso de precipitados de 200 ml con 60 ml de agua desionizada, cada una. Los vasos de precipitados se agitaron durante 2 min (200 rpm), posteriormente se transfirieron durante tres minutos a un baño ultrasónico (40 kHz) y nuevamente se agitaron durante 5 min (200 rpm). La mezcla de agua y hojas se filtró (malla de 80 µm) y el filtrado resultante se utilizó para analizar la densidad de esporas por medio de un hemocitómetro (cámara de recuento Fuchs-Rosenthal).

Los siguientes análisis se basaron en análisis del modelo lineal de efectos mixtos (LMM). Todos los análisis se realizaron en R versión 4.0.2 (R Core Team, 2019). Los análisis de Random Forest se realizaron utilizando el paquete randomForest versión 4.6-1485. Los modelos mixtos lineales se ajustaron con la versión nlme 3.1-148 y el análisis de componentes principales se realizó con el paquete vegano versión 2.5-686,87.

Para el análisis gráfico y estadístico, los datos ordinales de la mancha de la hoja y la mancha de la fruta se transformaron en datos continuos (porcentaje), usando los puntos medios de la clase para calcular las medias ponderadas (Área necrótica media [%], Número medio de manchas de la fruta por manzana) para cada lado del árbol de una parcela. La reducción en la mancha de la hoja y las manchas de la fruta se calculó mediante: (Tratamiento del área necrótica media / Control del área necrótica media)-1)*100.

El efecto de SBF y fungicidas (tratamientos) sobre la mancha foliar y la mancha del fruto se analizaron por separado para cada uno de los dos tratamientos y cada variedad de manzana ('Golden Delicious' y 'Cripps Pink'), respectivamente. Se utilizaron como variables de respuesta “Área foliar necrótica” (%) y “Número de manchas de frutos” (# fruto-1), respectivamente. El efecto fijo fue "Tratamiento" (SBF frente a control o Fungicida frente a control). Como teníamos datos de varios años, especificamos "Año" (2017–2019) y Bloque (Replicar; n = 4) como efectos aleatorios anidados con pendientes separadas (Año | Bloque).

Para probar si la susceptibilidad a la mancha foliar por Alternaria está relacionada con la concentración de nutrientes (Mg, Mn, S), usamos LMM con concentración de Mg, Mn, S como variables de respuesta. Se fijó como efecto fijo el "tipo de huerto" (prevalencia alta vs. baja). "Fecha" (n = 5, con 2 repeticiones cada una por huerto) y "ID del huerto" (2018: n = 8; 2019: n = 6) se especificaron como efecto aleatorio con pendientes separadas (Fecha|ID del huerto).

La "densidad de esporas" de las esporas de Alternaroid extraídas de las manchas foliares provocadas artificialmente (herbicida) y la mancha foliar natural se establecieron como variable dependiente. Los efectos fijos fueron "Tipo de necrosis de la hoja" (artificial versus natural) y "Fecha" de recolección de la hoja (3 de septiembre de 2019 versus 14 de octubre de 2019) con su interacción. "Bloquear" (Replicar; n = 4) se estableció como efecto aleatorio.

Usamos el área foliar necrótica relativa de los discos foliares como variable dependiente. Los valores de cada réplica representan la media de las réplicas técnicas correspondientes (n = 4). "Tipo de lesión" ("ninguno" frente a "una hora antes" frente a "7 días antes" frente a "ácaros") y "Aislar" (A18/F01/14 frente a A18/F03/09 frente a A18/F05 /11 vs. A18/F10/14) como efectos fijos, así como su potencial interacción. "Replicar" (n = 4) se especificó como efecto aleatorio.

Para vincular las concentraciones de nutrientes de las hojas con la prevalencia de manchas en las hojas, realizamos análisis de Random Forest para las variedades Golden y Pink por separado88. Para cada bosque, cultivamos 10.000 árboles, muestreando aleatoriamente 4 predictores para dividir en cada nodo. Las variables se clasificaron por su disminución media en la impureza de los nodos, medida por sumas residuales de cuadrados, y aquellas con un impacto desproporcionado se seleccionaron para un análisis posterior después de una inspección visual.

Posteriormente, los nutrientes seleccionados se usaron en modelos mixtos lineales generales para probar sus efectos en la severidad de la mancha foliar (transformada logarítmicamente) en las dos variedades para maximizar el poder estadístico. Se incluyeron efectos aleatorios para tener en cuenta las observaciones repetidas en las mismas parcelas a lo largo de los años. Los efectos fijos incluyeron la variedad, los nutrientes de la hoja seleccionados y las interacciones bidireccionales entre cada nutriente de la hoja y la variedad. Esto último permite que cada variedad tenga una relación diferente entre cada nutriente y la mancha foliar. Había muy pocos datos para explorar más interacciones entre los nutrientes.

Dos de los predictores seleccionados (S y Mg) fueron fuertemente colineales (Fig. 4 complementaria) e incluir ambos en el mismo modelo condujo a estimaciones inestables de los coeficientes de regresión. Para solucionar este problema, utilizamos dos enfoques. Primero, realizamos un análisis de componentes principales solo en los datos de S y Mg. El primer eje explicó la mayor parte de la variación (90,1%) en estos dos elementos, como era de esperar. Posteriormente, las puntuaciones de los ejes PCA (1 y 2) se usaron como predictores en el LMM (mod1, Tabla complementaria 5) para capturar simultáneamente los efectos de S y Mg en la mancha foliar. En segundo lugar, ajustamos dos LMM excluyendo Mg (mod2) o S (mod3) como predictores y comparamos el ajuste del modelo en función de los valores AIC89. Simplificamos aún más el modelo de mejor ajuste (mod2), utilizando pruebas de razón de verosimilitud (mod2a).

Los materiales vegetales utilizados en este estudio procedían de cultivos controlados y todas las recolectas se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales, nacionales e internacionales para la recolección de plantas silvestres.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio son de libre acceso en: https://doi.org/10.5281/zenodo.7963642.

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Nos gustaría agradecer a Markus Kelderer, Claudio Casera, Thomas Facchini, Gazmend Arslani und Bekir Musliu por su apoyo en el campo, Michaela Bertagnoll y Sabine Oettl por su apoyo en el laboratorio y proporcionar/identificar los aislamientos. Muchas gracias a Yazmid Reyez Domingues por el diagnóstico de hongos y discusión. Agradecemos a Martijn Bezemer y Emilia Hannula por la lectura crítica de los borradores anteriores. El estudio fue financiado por Apple Consortium South Tyrol (Terlan/Italia) (Prot. Nr. VZL.00/5881/85.00/MO-cg). ERJW recibió el apoyo de una subvención de movilidad NWO-Rubicon (Organización de los Países Bajos para la Investigación Científica, contrato n.º 019.181EN.01).

Instituto Terra, Säbenertorgasse 2, 39042, Brixen, BZ, Italia

Ulrich E. Prechsl, Werner Rizzoli y Klaus Marschall

Grupo de Agroecosistemas Sostenibles, Instituto de Ciencias Agrícolas, Departamento de Ciencias de Sistemas Ambientales, ETH Zürich, Universitätstrasse 2, 8092, Zúrich, Suiza

Urgencias Jasper Wubs

Departamento de Ecología Terrestre, Instituto de Ecología de los Países Bajos (NIOO-KNAW), PO Box 50, 6700 AB, Wageningen, Países Bajos

Urgencias Jasper Wubs

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UEP diseñó, implementó y evaluó todos los experimentos, excepto el experimento de almacenamiento de frutas donde KM asumió este rol. WR co-diseñó e implementó las pruebas de campo (tratamientos de campo) y realizó pruebas a largo plazo (>15 años) de fungicidas Alternaria. UEP y ERJW realizaron el análisis de datos y escribieron el manuscrito. Todos los autores proporcionaron comentarios constructivos sobre el manuscrito.

Correspondencia a Ulrich E. Prechsl.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Prechsl, UE, Rizzoli, W., Marschall, K. et al. El manejo libre de fungicidas de la mancha foliar y la mancha del fruto por Alternaria en la manzana indica Alternaria spp. como colonizador secundario. Informe científico 13, 8431 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35448-2

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Recibido: 10 enero 2023

Aceptado: 18 de mayo de 2023

Publicado: 24 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35448-2

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